РНФ. Противоопухолевые наночастицы

Грант Российского научного фонда (РНФ) на разработку оптимизированных методик синтеза металлосодержащих наночастиц, обладающих выраженным действием на опухолевые ткани.


Начало активности (дата): 11.09.2014
Окончание активности (дата): 31.12.2016
Название конкурса: грант Российского научного фонда на создание новых лабораторий по приоритетным направлениям развития России
Внутренний номер ЮФУ: 213/01-03/2014-9 РНФ
Финансирование (руб): 70000000
Пример благодарности в статьях: This study was financially supported by a grant of Russian Science Foundation (project № 14-35-00051).
Grant name: RNF


Грант Российского научного фонда на создание новых лабораторий 
по приоритетным направлениям развития России (2014-2016, А.В.Солдатов) 
проект ЮФУ № 213/01-03/2014-9 РНФ.


«Разработка оптимизированных методик синтеза металлосодержащих наночастиц, обладающих выраженным действием на опухолевые ткани, и комплексных технологий активизации механизмов противоопухолевой резистентности с использованием наноматериалов и персонализированных низкоинтенсивных системных воздействий»


    В рамках проекта за 2015 год проводились исследования по направлениям – разработка методик синтеза и получение широкого спектра наночастиц различного размера, состава, структуры и морфологии, и определение фундаментальных закономерностей их взаимодействия с опухолевыми тканями при модуляции активности регуляторных систем организма, с помощью методов активационной терапии. 

Разработаны методики синтеза и получены чистые и допированные атомами металлов магнитные железосодержащих наночастицы различного состава, размера и структуры. Варьирование методик синтеза позволяет получить наночастицы различного размера и формы. 



Рисунок 1. - Изображения ПЭМ для образцов магнитных железосодержащих наночастиц, синтезированных микроволновым полиольным синтезом А-в ЭГ, В-в растворе, содержащем 50% ЭГ, 50% ПЭГ, С – 100% ПЭГ. 


    Методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и ПЭМ высокого разрешения определяли средний размер и форму частиц, рассчитывали размерное распределение частиц. Для ряда образцов были рассчитаны значения межплоскостных расстояний из данных электронной дифракции. Типичные изображения ПЭМ с гистограммами распределения наночастиц по размеру представлен на рисунке 1. 



Рисунок 2. – Изображения ПЭМ а) чистых и б) допированных самарием наночастиц магнетита.

Рисунок 3. – Рентгенограммы чистых и допированных самарием наночастиц магнетита. 


    Изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) чистых и допированных самарием наночастиц магнетита, полученных микроволновым синтезом показаны на рисунке 2. Рентгенограммы чистых и допированных самарием наночастиц магнетита показаны на рисунке 3. Анализ изображений показывает, что распределение частиц по размерам достаточно узкое и частицы имеют почти сферическую форму. Размеры чистых наночастиц магнетита не превышает 40 нм, а при допировании наночастиц самарием размеры частиц уменьшаются, что совпадает с результатами по размерам наночастиц, полученного из анализа данных рентгеновской дифракции.
Магнитные наночастицы допированные атомами редкоземельных элементов аттестовались методом: порошковой рентгеновской дифракции. Для этого для полученных образцов регистрировались спектры в области углов 2Θ от 25 до 95º (Cu kα, λ= 0,15406 нм). Профили регистрировались с шагом сканирования 0.02° и временем экспозиции 2 с. Дифрактограмма типичных образцов представлены на рисунке 4. 



Рисунок 4. - Дифрактограммы оксида железа (1) и допированных оксидов железа 2- Sm3+, 3- Gd3+, 4-Eu3+. 


    Средний размер частиц рассчитывался как по формуле Шеррера, так и методом Вильямсона-Холла, позволяющего учитывать вклад микродеформаций в средний размер кристаллита. Содержание допирующих элементов определяли рентгенофлюоресцентным методом на двухмерном микро-РФ спектрометре M4 TORNADO (Bruker).
Разработаны методики синтеза и получены магнитные железосодержащие наночастицы разных размеров. Частицы наименьшего размера (4,5 нм) получали модифицированным соосаждением в микроволновой печи с добавлением наночастиц золота в качестве затравки (см. рисунок 5). Частицы наибольшего размера (30 нм) получались варьированием классического метода соосаждения. Микроволновым синтезом получали частицы размером 6-17 нм.
Использование микроволнового полиольного синтеза в основном приводило к образованию сферических частиц. Сольвотермальный синтез с использованием 2,2'-бипиридина в качестве стабилизатора позволяет получить наностицы в виде игл, а модифицированный метод соосаждения с ультразвуковой обработкой реакционной смеси в процессе синтез - наночастицы в виде пластинок. 



Рисунок 5. - Структурная характеризация наночастиц оксида железа, полученных модифицированным методом соосаждением в микроволновой печи с добавлением наночастиц золота в качестве затравки: (a) рентгенограмма, (b) гистограмма распределения по размерам, (c) изображение ПЭМ высокого разрешения синтезированных наночастиц. 


    Полученные наночастицы характеризовались разной степенью агломерированности. Наименее агрегированные частицы получались в случае микроволнового синтеза в системе олеиламин/олеиновая кислота. Установлено влияние природы и состава органического растворителя, а также условий микроволнового синтеза на средний размер, размерное распределение и степень агломерации частиц. Проведена лабораторная диагностика распределения по размеру, атомной и электронной структур, а также морфологии допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц различного состава, размера и структуры. Определены типы образующихся оксидов железа. Для этого синтезированные материалы исследовали различными экспериментальными методиками. Варьирование методик синтеза позволяет получить как магнетит, так и маггемит или смесь этих оксидов. Только микроволновой синтез в глицерине при температурах до 275º С приводил к образованию α-Fe2O3. Поверхностный слой, состоящий из маггемита (γ-Fe2O3), составляет относительно небольшую долю по сравнению с фазой магнетита, для чистых наночастиц (~30 нм) составляет ~0.9 нм, а для допированных самарием наночастиц (~10 нм) составляет ~0.3 нм. Проведены измерения спектров XANES и EXAFS для образцов допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц различного состава, размера и структуры. Анализ спектров поглощения позволил определить структуру, параметры локальной атомной структуры, степень окисления железа и редкоземельных элементов в допированных магнитных наночастицах, положение ионов допирующих элементов в структуре магнитных наночастиц. Исследован процесс окисления наночастиц в виде наноразмерных порошков и коллоидных растворов (см. рисунок 6). 



Рисунок 6. - a) Fe K-XANES спектры и анализ степени окисления железа и самария в чистых и допированных самарием (3%) наночастицах магнетита; b) Область Fe K-края и позиция по энергии края поглощения; c) Окисление наночастиц магнетита и положения края поглощения чистых и допированных самарием (3%) наночастиц магнетита; d) Sm L3-XANES спектры допированных самарием (3%) наночастиц магнетита в сравнении с эталонным спектром Sm2O3.

    Определены магнитные характеристики (намагниченность, магнитный момент) наночастиц с помощью вибрационного магнитометра (см. рисунок 7, таблица 1) и данным рентгеновского магнитного кругового дихроизма (XMCD). Синтезированные чистые и допированные редкоземельными элементами магнитные наночастицы показывают в основном суперпарамагнитное поведение. Установлено, что допирование наночастиц редкоземельными элементами в небольшом количестве позволяет улучшить их магнитные характеристики. Установлено, что допирование наночастиц редкоземельными элементами в небольшом количестве позволяет уменьшить средний размер наночастиц, получить узкое распределение по размерам, повысить стойкость к окислению и улучшить их магнитные характеристики.



Рисунок 7. – а) Петли гистерезиса чистых и допированных самарием наночастиц магнетита, б) значения остаточной намагниченности и коэрцитивной силы чистых и допированных самарием наночастиц магнетита.

Таблица 1. - Магнитные параметры чистых и допированных самарием наночастиц магнетита.

Наночастицы Намагниченность насыщения Ms, э.м.е./г Коэрцитивная сила Hc, T Остаточная намагниченность Mr, э.м.е./г
Наночастицы магнетита (Fe3O4) 74.9 0.0075 14.96
Допированные самарием наночастицы магнетита (Fe3O4:Sm) 122.1 0.0001 0.30

    Разработка методики и тестовый синтез функционализированных наночастиц для рентгеновской фотодинамической терапии.
   Для синтеза комплекса меди, 0,460 г CuCl2·2H2O (2,698 моль) было растворено в деионизированной воде с последующим добавлением 0,636 г цистеамина (8,244 моль). В избытке цистеамина Cu2+ восстанавливается до Cu+ в соответствии с уравнением 2HSR+Cu(II)=Cu(I)-SR+ ½ RSSR +2H+, где R = CH2CH2NH2. После доведения pH среды до 8 путём добавления 2,5 М раствора NaOH раствор перемешивался около 2 часов при комнатной температуре до появления окраски насыщенно-фиолетового цвета. Промежуточный продукт, содержащий как Cu(I), так и Cu(II) в соединении, выражающемся общей формулой Cu(II)2(SR)2O-Cu(I)4(SR)4, и обуславливает фиолетовую окраску.
Затем раствор был нагрет в течение 30 минут до точки кипения. После отстаивания выпавшие кристаллы Cu3Cl(SR)2 были отделены от раствора над осадком. Полученные кристаллы Cu3Cl(SR)2 были центрифугированы и промыты 3 раза раствором, содержащим деионизированную воду и этанол в объёмных соотношениях 5:4. Затем, кристаллы были высушены в вакуумной печи при комнатной температуре в течение ночи. Также в течение длительного времени без перемешивания были выращены одиночные монокристаллы.
Изучение влияния допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц на рост и цитологические характеристики культур опухолевых и немалигнизированных клеток, а также на состояние ксенографтов некоторых опухолей человека, в зависимости состава, размера и структуры наночастиц
    В связи с актуальностью для онкологии вопроса об эффектах наночастиц-ферримагнетиков на малигнизированные и иммунокомпетентные клетки было изучено влияние различных наночастиц (НЧ) на апоптоз моноцитов, нормальных и малигнизированных лимфоцитов, а также на иммунофенотип лимфоцитов in vitro. При этом были исследованы следующие нанофакторы: НЧ магнетита 16-17 нм, стабилизированные раствором 2,2-бипиридина, НЧ магнетита 20-22 нм, стабилизированные олеиновой кислотой (магнитная жидкость АМ-01), НЧ магнетита, допированные самарием (Sm, 2.7%), стабилизированные нафионом,  НЧ магнетита, допированные европием (Eu, 2.7%), стабилизированные нафионом. На основании результатов предыдущих исследований были выбраны концентрации, различавшиеся на два порядка - 1 и 0,01 мкг/мл. С помощью проточной цитофлюориметрии на анализаторе FACS CantoII исследовали кровь больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом и кровь здоровых доноров, инкубированную с НЧ магнетита 4 видов в двух выбранных концентрациях. Также проводили изучение влияния магнитных НЧ без допирования на рост ксенографтов опухолей легких человека в диффузионных камерах (ДК). ДК имплантировали в брюшную полость крыс по 3 камеры на каждое животное. Взвесь НЧ вводили крысам ежедневно внутрибрюшинно в течение 6 дней в суммарной дозе 10 мкг. В дальнейшем проводили микроскопическое изучение опухолевых клеток. Были получены результаты, свидетельствующие о влиянии состава и структуры ферримагнитных НЧ на их эффекты в отношении нормальных и малигнизированных клеток иммунной системы.
    Изучение системного и местного токсического влияния магнитных железосодержащих наночастиц в зависимости от состава и структуры наночастиц (магнетит, допированный атомами металлов и без допирования), размера у крыс без опухолей и животных-опухоленосителей.
   Изменения в крови и тканях животных без опухолей и крыс-опухоленосителей изучали с помощью методов цитологии, гистологии и гистохимии (обзорная окраска гематоксилин-эозином, выявление нуклеиновых кислот по методу Браше). При этом исследовали изменения микрокартины почек, печени, легких, селезенки, тимуса, надпочечников. Для оценки уровня эндогенной интоксикации изучали следующие биохимические показатели: содержание в крови животных молекул средней массы (МСМ), отражающее накопление токсических лигандов, для определения детоксикационного потенциала крови изучали изменение общей и эффективной концентрации альбумина (ОКА и ЭКА). Рассчитывали степень сорбции токсических лигандов (резервную связывающую способность альбумина - ССА), коэффициент интоксикации, отражающий баланс между накоплением и связыванием токсических лигандов и индекс токсичности, характеризующий функциональное состояние альбумина (сорбционную способность), в значительной степени отражающий вклад недостаточности функций печени в развитие эндогенной интоксикации. Биохимические исследования проводились на биохимическом анализаторе Cobas integra 400 plus и спректрофотометре HITACHI U-2900.

 Крысы без опухолей.

    Эксперименты проводили на половозрелых крысах-самцах (170–250 г). НЧ магнетита в разовой дозе 17.7 мг/кг, суммарной дозе 106.2 мг/кг (за 6 введений в течение 2-3 недель) при подкожном и внутримышечном введении. Эта доза являлась максимальной ("большой") разовой дозой при использовании НЧ магнетита, как без допирования, так и допированных самарием. В подавляющем большинстве случаев у крыс, подвергавшихся действию НЧ магнетита в разных дозах, к концу эксперимента отмечали развитие антистрессорных адаптационных реакций без выраженных элементов напряженности, что соответствовало спектру адаптационных реакций у интактных животных (контрольная группа). В двух случаях наблюдали гематологические признаки, которые могли свидетельствовать о некотором нарушении регуляторных взаимоотношений в организме. При исследовании внутренних органов – почек, печени, легких, селезенки, тимуса, надпочечников и селезенки – не было выявлено заметных признаков структурно-функциональных нарушений, обусловленных введением НЧ магнетита в исследованной дозе (см. рисунок 8). В печени отмечали умеренное полнокровие, что наблюдалось также и у интактных животных контрольной группы.

Рисунок 8. - Исследование токсического действия НЧ магнетита (без допирования, МЖ) у крыс без опухолей. Отсутствие признаков повреждения внутренних органов крыс без опухолей с подкожным и внутримышечным введением наночастиц магнетита в разовой дозе 17.7 мг/кг. Браше. Х400. А. Корковое вещество почек. Структура клубочков и канальцев без отклонений от нормы. Б. Структура легких без отклонений от нормы.


    При изучении изменений в тканях из зоны введения НЧ магнетита при подкожном введении была отмечена стертость поперечной исчерченности клеток мышечной ткани только непосредственно в местах введения наночастиц магнетита (см. рисунок 9А). В соседних с ними мышечных волокнах не наблюдали каких-либо признаков структурных нарушений. Для микрокартины тканей из зоны введения НЧ магнетита было характерным наличие обширных участков, заполненных скоплениями коричневых зернистых масс, очевидно, агрегациями наночастиц магнетита, и расположенных в непосредственной близости от них групп клеточных элементов, содержавших гранулы в цитоплазме (см. рисунок 9Б), идентифицированных как макрофаги, фагоцитировавшие НЧ магнетита наночастицы.


Рисунок 9. - Исследование токсического действия НЧ магнетита (без допирования, МЖ) у крыс без опухолей. Изменения в мышечной ткани в зоне введения наночастиц магнетита в разовой дозе 17.7 мг/кг. Крысы без опухоли. Браше. Х400. А. Стертость поперечной исчерченности мышечных волокон непосредственно в месте введения и выраженная поперечная исчерченность в соседних с ними мышечных волокнах. Б. Группы макрофогальных элементов с гранулами в цитоплазме в зонах скопления агрегатов наночастиц магнетита.

Крысы-опухоленосители. 

    При оценке местных токсических эффектов (в зоне введения наночастиц – перитуморальной зоне) наночастиц ферримагнетиков в «большой» дозе (17.7 мг/кг и 106 мг/кг – соответственно, разовая и суммарная доза) наблюдалась микрокартина сходная с той, что была отмечена у крыс без опухолей. При изучении внутренних органов была отмечена корреляция показателей морфо-функционального состояния органов иммунной системы и выраженности эффекта на опухоль. Так, в случае регрессии опухолей наблюдалась активизация лимфопролиферативной активности и межклеточных взаимодействий с участием тимоцитов и тканевых базофилов в тимусе, спленоцитов и макрофагов в селезенке. При отсутствии выраженного противоопухолевого эффекта микрокартина исследованных органов заметно не отличалась от той, которая наблюдалась у животных-опухоленосителей контрольной группы. Исследование показателей эндогенной интоксикации выявило, что в группе крыс с лимфосаркомой Плисса без воздействия (контрольная группа) имело место статистически значимое снижение общей и эффективной концентрации альбумина и его связывающей относительно средних значений у интактных животных (крысы без опухоли). Это привело к кратному увеличению интегральных показателей эндогенной интоксикации – индекса токсичности и коэффициента интоксикации (см. рисунок 10).


* - отличается от значений в интактнойгруппе, p<0.05 – 0.01
** - отличается от значений в контрольной группе, p<0.05 – 0.01

Рисунок 10. - Изменение интегральных показателей эндогенной интоксикации в крови животных с лимфосаркомой Плисса при воздействии наночастиц магнетита (НЧ магн.) и магнитных железо-содержащих наночастиц допированных атомами самария (НЧ магн. доп.); в процентах по отношению к значениям в группе доноров, принятых за 100%.


    Перитуморальное введение НЧ магнетита крысам-опухоленосителям в суммарной дозе 106,2 мг/кг не усугубило проявлений эндогенной интоксикации. Напротив, отмечалось тенденция к повышению сорбционных свойств альбумина – увеличение ЭКА и ССА на 33 и 30 % соответственно, и снижение уровня МСМ (на 21-43%) относительно средних значений в контрольной группе, что привело к снижению интегральных показателей эндогенной интоксикации – индекса токсичности и коэффициента интоксикации, у большинства опытных животных. Перитуморальное введение допированных самарием магнитных железо-содержащих наночастиц в суммарной дозе 106,2 мг/кг сопровождалось увеличением общей концентрации альбумина до уровня нормативных значений, повышением ЭКА и снижением МСМ относительно значений в контрольной группе на 28 % и 20 % соответственно. Наблюдалось статистически значимое кратное снижение коэффициента интоксикации и индекса токсичности относительно контроля. Таким образом, перитуморальное введение НЧ магнетита и допированных самарием НЧ в "больших" дозах не приводит к усилению эндотоксикоза, характерного для злокачественного роста и сопровождается тенденцией к нормализации исследованных показателей у большей части опытных животных.
    Изучение эффектов допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц на развитие перевивных опухолей различных гистотипов в зависимости от состава и структуры наночастиц, а также от дозы и способа введения в организм животных
    Эффекты НЧ магнетита без допирования и НЧ магнетита, допированных самарием, вводившихся внутрибрюшинно, пери- и интратуморально были изучены в экспериментах на 250 крысах с перевивными саркомой 45 и лимфосаркомой Плисса и 74 мышах линии С57 Black c меланомой В 16, самцах и самках. Исследованные НЧ вводили в двух разных дозах, "большой" (разовая - 17.7 мг/кг) и "малой" (разовая - 1.25 мг/кг). Трансплантацию опухолей осуществляли путем инокуляции взвеси опухолевых клеток в заднебоковую поверхность спины по стандартной методике. Ежедневно осуществляли наблюдение за общим состоянием животных и взвешивание, определяли размеры опухолей. В случае лимфосаркомы Плисса наблюдалась регрессия опухоли разной степени выраженности, вплоть до полной регрессии. У крыс с саркомой 45 эффект выражался в торможении роста опухоли (до 4 раз), а также в её полной или частичной (на 40-60%) регрессии. У мышей линии С57 Black наблюдалось торможение роста меланомы В 16 и/или увеличение продолжительности жизни животных (см. рисунок 11). При использовании допированных самарием и не допированных НЧ магнетита в «малой» дозе наблюдалось усиление их противоопухолевого действия, что выражалось в существенном увеличении числа случаев полной и выраженной (не менее чем в 2 раза) регрессии опухоли (см. рисунок 12).

 

* - отличается от значений в контрольной группе, p<0.05 – 0.01

Рисунок 11. - Увеличение продолжительности жизни мышей-самок линии С57Black/6 с растущей меланомой В16 при воздействии наночастиц магнетита (НЧ магн.) и слабого инфранизкочастотного магнитного поля (МП). Обозначения: 1 п/г - подгруппа животных с наиболее выраженным эффектом, 2 п/г - подгруппа животных с менее выраженным эффектом.



Рисунок 12. – Усиление противоопухолевого эффекта НЧ магнетита без допирования (НЧ магн.) у крыс с лимфосаркомой Плисса при дополнительном центральном магнитном воздействии и снижении дозы. 


    Сравнение эффектов на опухоли животных допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц с влиянием наночастиц магнетита и переходных биогенных металлов.
  Сравнительное изучение противоопухолевой эффективности введения НЧ оксида меди (средний диаметр частиц 70-80 нм, сферической формы) и допированных атомами самария магнитных железо-содержащих НЧ было проведено на беспородных крысах-самцах с лимфосаркомой Плисса. В целом, доля животных с эффектом от введения наночастиц для крыс, получавших допированные НЧ магнетита составила 78%, а для крыс, получавших НЧ оксида меди – 71%. В отличие от допированных самарием железо-содержащих наночастиц, проявивших большую эффективность при внутрибрюшинном способе введения ингибирование роста лимфосаркомы Плисса наночастицами меди было наиболее выраженным при внутриопухолевом способе введения, при котором отмечалась регрессия опухоли различной степени выраженности в 55 % случаев (у 11 из 20 крыс), торможение роста опухоли у 25% крыс, рост опухоли у 20% животных. В то время как внутрибрюшинное введение наночастиц меди вызывало регрессию лимфосаркомы в 43% случаев (у 6 из 14 крыс), торможение роста у 14 % и рост опухоли у 43 %  животных.
Модификация противоопухолевого влияния наночастиц магнетита, переходных биогенных металлов и допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц с помощью низкоинтенсивных магнитных воздействий (активационная магнитотерапия). Сравнение полученных эффектов с использованием циклического аденозин-монофосфата (ЦАМФ) при злокачественном процессе.
Магнитное воздействие осуществляли на голову крыс. В случае экспериментов на мышах линии С57 Black применяли общее воздействие с одновременным облучением 5 животных, находившихся в специальной камере. Электромагнитное воздействие осуществляли с помощью аппарата «Градиент-2» по алгоритмам активационной терапии, для чего использовали ИНЧ МП нескольких частот в диапазоне 0.03 – 9 Гц, индукцией не более 3.5 мТл. Введение НЧ осуществляли перитуморально 2-3 раза в неделю (в разных экспериментах). Курс воздействий составлял 2.5-3.5 недели. Интерес представляло сопоставление эффектов комплексного воздействия с эффектами модифицированной циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ) химиотерапии опухолей в с вязи с важной регуляторной ролью цАМФ как универсального вторичного мессенджера и перспективностью дальнейшего использования этого фактора для модификации эффектов магнитных НЧ. Было изучено комплексное влияние магнитного воздействия и наночастиц-ферримагнетиков (допированных самарием и без допирования) при их перитуморальном введении у крыс с лимфосаркомой Плисса. А также сравнения эффектов этих факторов с действием модифицированной цАМФ химиотерапией  животных с крупными опухолями. Терапия включала ежедневное в течение 15 дней введение per os через желудочный зонд цАМФ (0,03 мг/мл) и 4-х кратное с интервалом 5 дней внутрибрюшинное введение циклофосфана.
    Аналогично тому, что было отмечено при использовании НЧ магнетита, допированных и без допирования, в случае комплексного действия слабого поличастотного магнитного излучения и наночастиц-ферримагнетиков наблюдалась связь противоопухолевого и антистрессорного влияния исследованного комплексного воздействия. Добавление магнитного воздействия усиливало антистрессорный и противоопухолевый эффект наночастиц-ферримагнетиков (см. рисунок 13) с допированием и без допирования (в 1.2-2 раза).


Рисунок 13. - Сравнительная динамика роста лимфосаркомы Плисса при внутрибрюшинном введении наночастиц магнетита оксида меди и магнитных железо-содержащих наночастиц допированных атомами самария. 


    Проведена отработка методики изучения распределения наночастиц оксидов железа в опухоли, тканях перитуморальной зоны. На рисунке 14 показана двумерная карта распределения железа в тканях перитуморальной зоны, полученная рентгенофлюоресцентным методом на двухмерном микро-РФ спектрометре M4 TORNADO (Bruker).


Рисунок 14. – Двумерная карта распределения железа в ткани перитуморальной зоны.