РНФ. Противоопухолевые наночастицы

Грант Российского научного фонда (РНФ) на разработку оптимизированных методик синтеза металлосодержащих наночастиц, обладающих выраженным действием на опухолевые ткани.




Грант Российского научного фонда на создание новых лабораторий 
по приоритетным направлениям развития России (2014-2016, А.В.Солдатов) 
проект ЮФУ № 213/01-03/2014-9 РНФ.


«Разработка оптимизированных методик синтеза металлосодержащих наночастиц, обладающих выраженным действием на опухолевые ткани, и комплексных технологий активизации механизмов противоопухолевой резистентности с использованием наноматериалов и персонализированных низкоинтенсивных системных воздействий»


    В рамках проекта за 2015 год проводились исследования по направлениям – разработка методик синтеза и получение широкого спектра наночастиц различного размера, состава, структуры и морфологии, и определение фундаментальных закономерностей их взаимодействия с опухолевыми тканями при модуляции активности регуляторных систем организма, с помощью методов активационной терапии. 

Разработаны методики синтеза и получены чистые и допированные атомами металлов магнитные железосодержащих наночастицы различного состава, размера и структуры. Варьирование методик синтеза позволяет получить наночастицы различного размера и формы. 



Рисунок 1. - Изображения ПЭМ для образцов магнитных железосодержащих наночастиц, синтезированных микроволновым полиольным синтезом А-в ЭГ, В-в растворе, содержащем 50% ЭГ, 50% ПЭГ, С – 100% ПЭГ. 


    Методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и ПЭМ высокого разрешения определяли средний размер и форму частиц, рассчитывали размерное распределение частиц. Для ряда образцов были рассчитаны значения межплоскостных расстояний из данных электронной дифракции. Типичные изображения ПЭМ с гистограммами распределения наночастиц по размеру представлен на рисунке 1. 



Рисунок 2. – Изображения ПЭМ а) чистых и б) допированных самарием наночастиц магнетита.

Рисунок 3. – Рентгенограммы чистых и допированных самарием наночастиц магнетита. 


    Изображения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) чистых и допированных самарием наночастиц магнетита, полученных микроволновым синтезом показаны на рисунке 2. Рентгенограммы чистых и допированных самарием наночастиц магнетита показаны на рисунке 3. Анализ изображений показывает, что распределение частиц по размерам достаточно узкое и частицы имеют почти сферическую форму. Размеры чистых наночастиц магнетита не превышает 40 нм, а при допировании наночастиц самарием размеры частиц уменьшаются, что совпадает с результатами по размерам наночастиц, полученного из анализа данных рентгеновской дифракции.
Магнитные наночастицы допированные атомами редкоземельных элементов аттестовались методом: порошковой рентгеновской дифракции. Для этого для полученных образцов регистрировались спектры в области углов 2Θ от 25 до 95º (Cu kα, λ= 0,15406 нм). Профили регистрировались с шагом сканирования 0.02° и временем экспозиции 2 с. Дифрактограмма типичных образцов представлены на рисунке 4. 



Рисунок 4. - Дифрактограммы оксида железа (1) и допированных оксидов железа 2- Sm3+, 3- Gd3+, 4-Eu3+. 


    Средний размер частиц рассчитывался как по формуле Шеррера, так и методом Вильямсона-Холла, позволяющего учитывать вклад микродеформаций в средний размер кристаллита. Содержание допирующих элементов определяли рентгенофлюоресцентным методом на двухмерном микро-РФ спектрометре M4 TORNADO (Bruker).
Разработаны методики синтеза и получены магнитные железосодержащие наночастицы разных размеров. Частицы наименьшего размера (4,5 нм) получали модифицированным соосаждением в микроволновой печи с добавлением наночастиц золота в качестве затравки (см. рисунок 5). Частицы наибольшего размера (30 нм) получались варьированием классического метода соосаждения. Микроволновым синтезом получали частицы размером 6-17 нм.
Использование микроволнового полиольного синтеза в основном приводило к образованию сферических частиц. Сольвотермальный синтез с использованием 2,2'-бипиридина в качестве стабилизатора позволяет получить наностицы в виде игл, а модифицированный метод соосаждения с ультразвуковой обработкой реакционной смеси в процессе синтез - наночастицы в виде пластинок. 



Рисунок 5. - Структурная характеризация наночастиц оксида железа, полученных модифицированным методом соосаждением в микроволновой печи с добавлением наночастиц золота в качестве затравки: (a) рентгенограмма, (b) гистограмма распределения по размерам, (c) изображение ПЭМ высокого разрешения синтезированных наночастиц. 


    Полученные наночастицы характеризовались разной степенью агломерированности. Наименее агрегированные частицы получались в случае микроволнового синтеза в системе олеиламин/олеиновая кислота. Установлено влияние природы и состава органического растворителя, а также условий микроволнового синтеза на средний размер, размерное распределение и степень агломерации частиц. Проведена лабораторная диагностика распределения по размеру, атомной и электронной структур, а также морфологии допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц различного состава, размера и структуры. Определены типы образующихся оксидов железа. Для этого синтезированные материалы исследовали различными экспериментальными методиками. Варьирование методик синтеза позволяет получить как магнетит, так и маггемит или смесь этих оксидов. Только микроволновой синтез в глицерине при температурах до 275º С приводил к образованию α-Fe2O3. Поверхностный слой, состоящий из маггемита (γ-Fe2O3), составляет относительно небольшую долю по сравнению с фазой магнетита, для чистых наночастиц (~30 нм) составляет ~0.9 нм, а для допированных самарием наночастиц (~10 нм) составляет ~0.3 нм. Проведены измерения спектров XANES и EXAFS для образцов допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц различного состава, размера и структуры. Анализ спектров поглощения позволил определить структуру, параметры локальной атомной структуры, степень окисления железа и редкоземельных элементов в допированных магнитных наночастицах, положение ионов допирующих элементов в структуре магнитных наночастиц. Исследован процесс окисления наночастиц в виде наноразмерных порошков и коллоидных растворов (см. рисунок 6). 



Рисунок 6. - a) Fe K-XANES спектры и анализ степени окисления железа и самария в чистых и допированных самарием (3%) наночастицах магнетита; b) Область Fe K-края и позиция по энергии края поглощения; c) Окисление наночастиц магнетита и положения края поглощения чистых и допированных самарием (3%) наночастиц магнетита; d) Sm L3-XANES спектры допированных самарием (3%) наночастиц магнетита в сравнении с эталонным спектром Sm2O3.

    Определены магнитные характеристики (намагниченность, магнитный момент) наночастиц с помощью вибрационного магнитометра (см. рисунок 7, таблица 1) и данным рентгеновского магнитного кругового дихроизма (XMCD). Синтезированные чистые и допированные редкоземельными элементами магнитные наночастицы показывают в основном суперпарамагнитное поведение. Установлено, что допирование наночастиц редкоземельными элементами в небольшом количестве позволяет улучшить их магнитные характеристики. Установлено, что допирование наночастиц редкоземельными элементами в небольшом количестве позволяет уменьшить средний размер наночастиц, получить узкое распределение по размерам, повысить стойкость к окислению и улучшить их магнитные характеристики.



Рисунок 7. – а) Петли гистерезиса чистых и допированных самарием наночастиц магнетита, б) значения остаточной намагниченности и коэрцитивной силы чистых и допированных самарием наночастиц магнетита.

Таблица 1. - Магнитные параметры чистых и допированных самарием наночастиц магнетита.

Наночастицы Намагниченность насыщения Ms, э.м.е./г Коэрцитивная сила Hc, T Остаточная намагниченность Mr, э.м.е./г
Наночастицы магнетита (Fe3O4) 74.9 0.0075 14.96
Допированные самарием наночастицы магнетита (Fe3O4:Sm) 122.1 0.0001 0.30

    Разработка методики и тестовый синтез функционализированных наночастиц для рентгеновской фотодинамической терапии.
   Для синтеза комплекса меди, 0,460 г CuCl2·2H2O (2,698 моль) было растворено в деионизированной воде с последующим добавлением 0,636 г цистеамина (8,244 моль). В избытке цистеамина Cu2+ восстанавливается до Cu+ в соответствии с уравнением 2HSR+Cu(II)=Cu(I)-SR+ ½ RSSR +2H+, где R = CH2CH2NH2. После доведения pH среды до 8 путём добавления 2,5 М раствора NaOH раствор перемешивался около 2 часов при комнатной температуре до появления окраски насыщенно-фиолетового цвета. Промежуточный продукт, содержащий как Cu(I), так и Cu(II) в соединении, выражающемся общей формулой Cu(II)2(SR)2O-Cu(I)4(SR)4, и обуславливает фиолетовую окраску.
Затем раствор был нагрет в течение 30 минут до точки кипения. После отстаивания выпавшие кристаллы Cu3Cl(SR)2 были отделены от раствора над осадком. Полученные кристаллы Cu3Cl(SR)2 были центрифугированы и промыты 3 раза раствором, содержащим деионизированную воду и этанол в объёмных соотношениях 5:4. Затем, кристаллы были высушены в вакуумной печи при комнатной температуре в течение ночи. Также в течение длительного времени без перемешивания были выращены одиночные монокристаллы.
Изучение влияния допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц на рост и цитологические характеристики культур опухолевых и немалигнизированных клеток, а также на состояние ксенографтов некоторых опухолей человека, в зависимости состава, размера и структуры наночастиц
    В связи с актуальностью для онкологии вопроса об эффектах наночастиц-ферримагнетиков на малигнизированные и иммунокомпетентные клетки было изучено влияние различных наночастиц (НЧ) на апоптоз моноцитов, нормальных и малигнизированных лимфоцитов, а также на иммунофенотип лимфоцитов in vitro. При этом были исследованы следующие нанофакторы: НЧ магнетита 16-17 нм, стабилизированные раствором 2,2-бипиридина, НЧ магнетита 20-22 нм, стабилизированные олеиновой кислотой (магнитная жидкость АМ-01), НЧ магнетита, допированные самарием (Sm, 2.7%), стабилизированные нафионом,  НЧ магнетита, допированные европием (Eu, 2.7%), стабилизированные нафионом. На основании результатов предыдущих исследований были выбраны концентрации, различавшиеся на два порядка - 1 и 0,01 мкг/мл. С помощью проточной цитофлюориметрии на анализаторе FACS CantoII исследовали кровь больных хроническим В-клеточным лимфолейкозом и кровь здоровых доноров, инкубированную с НЧ магнетита 4 видов в двух выбранных концентрациях. Также проводили изучение влияния магнитных НЧ без допирования на рост ксенографтов опухолей легких человека в диффузионных камерах (ДК). ДК имплантировали в брюшную полость крыс по 3 камеры на каждое животное. Взвесь НЧ вводили крысам ежедневно внутрибрюшинно в течение 6 дней в суммарной дозе 10 мкг. В дальнейшем проводили микроскопическое изучение опухолевых клеток. Были получены результаты, свидетельствующие о влиянии состава и структуры ферримагнитных НЧ на их эффекты в отношении нормальных и малигнизированных клеток иммунной системы.
    Изучение системного и местного токсического влияния магнитных железосодержащих наночастиц в зависимости от состава и структуры наночастиц (магнетит, допированный атомами металлов и без допирования), размера у крыс без опухолей и животных-опухоленосителей.
   Изменения в крови и тканях животных без опухолей и крыс-опухоленосителей изучали с помощью методов цитологии, гистологии и гистохимии (обзорная окраска гематоксилин-эозином, выявление нуклеиновых кислот по методу Браше). При этом исследовали изменения микрокартины почек, печени, легких, селезенки, тимуса, надпочечников. Для оценки уровня эндогенной интоксикации изучали следующие биохимические показатели: содержание в крови животных молекул средней массы (МСМ), отражающее накопление токсических лигандов, для определения детоксикационного потенциала крови изучали изменение общей и эффективной концентрации альбумина (ОКА и ЭКА). Рассчитывали степень сорбции токсических лигандов (резервную связывающую способность альбумина - ССА), коэффициент интоксикации, отражающий баланс между накоплением и связыванием токсических лигандов и индекс токсичности, характеризующий функциональное состояние альбумина (сорбционную способность), в значительной степени отражающий вклад недостаточности функций печени в развитие эндогенной интоксикации. Биохимические исследования проводились на биохимическом анализаторе Cobas integra 400 plus и спректрофотометре HITACHI U-2900.

 Крысы без опухолей.

    Эксперименты проводили на половозрелых крысах-самцах (170–250 г). НЧ магнетита в разовой дозе 17.7 мг/кг, суммарной дозе 106.2 мг/кг (за 6 введений в течение 2-3 недель) при подкожном и внутримышечном введении. Эта доза являлась максимальной ("большой") разовой дозой при использовании НЧ магнетита, как без допирования, так и допированных самарием. В подавляющем большинстве случаев у крыс, подвергавшихся действию НЧ магнетита в разных дозах, к концу эксперимента отмечали развитие антистрессорных адаптационных реакций без выраженных элементов напряженности, что соответствовало спектру адаптационных реакций у интактных животных (контрольная группа). В двух случаях наблюдали гематологические признаки, которые могли свидетельствовать о некотором нарушении регуляторных взаимоотношений в организме. При исследовании внутренних органов – почек, печени, легких, селезенки, тимуса, надпочечников и селезенки – не было выявлено заметных признаков структурно-функциональных нарушений, обусловленных введением НЧ магнетита в исследованной дозе (см. рисунок 8). В печени отмечали умеренное полнокровие, что наблюдалось также и у интактных животных контрольной группы.

Рисунок 8. - Исследование токсического действия НЧ магнетита (без допирования, МЖ) у крыс без опухолей. Отсутствие признаков повреждения внутренних органов крыс без опухолей с подкожным и внутримышечным введением наночастиц магнетита в разовой дозе 17.7 мг/кг. Браше. Х400. А. Корковое вещество почек. Структура клубочков и канальцев без отклонений от нормы. Б. Структура легких без отклонений от нормы.


    При изучении изменений в тканях из зоны введения НЧ магнетита при подкожном введении была отмечена стертость поперечной исчерченности клеток мышечной ткани только непосредственно в местах введения наночастиц магнетита (см. рисунок 9А). В соседних с ними мышечных волокнах не наблюдали каких-либо признаков структурных нарушений. Для микрокартины тканей из зоны введения НЧ магнетита было характерным наличие обширных участков, заполненных скоплениями коричневых зернистых масс, очевидно, агрегациями наночастиц магнетита, и расположенных в непосредственной близости от них групп клеточных элементов, содержавших гранулы в цитоплазме (см. рисунок 9Б), идентифицированных как макрофаги, фагоцитировавшие НЧ магнетита наночастицы.


Рисунок 9. - Исследование токсического действия НЧ магнетита (без допирования, МЖ) у крыс без опухолей. Изменения в мышечной ткани в зоне введения наночастиц магнетита в разовой дозе 17.7 мг/кг. Крысы без опухоли. Браше. Х400. А. Стертость поперечной исчерченности мышечных волокон непосредственно в месте введения и выраженная поперечная исчерченность в соседних с ними мышечных волокнах. Б. Группы макрофогальных элементов с гранулами в цитоплазме в зонах скопления агрегатов наночастиц магнетита.

Крысы-опухоленосители. 

    При оценке местных токсических эффектов (в зоне введения наночастиц – перитуморальной зоне) наночастиц ферримагнетиков в «большой» дозе (17.7 мг/кг и 106 мг/кг – соответственно, разовая и суммарная доза) наблюдалась микрокартина сходная с той, что была отмечена у крыс без опухолей. При изучении внутренних органов была отмечена корреляция показателей морфо-функционального состояния органов иммунной системы и выраженности эффекта на опухоль. Так, в случае регрессии опухолей наблюдалась активизация лимфопролиферативной активности и межклеточных взаимодействий с участием тимоцитов и тканевых базофилов в тимусе, спленоцитов и макрофагов в селезенке. При отсутствии выраженного противоопухолевого эффекта микрокартина исследованных органов заметно не отличалась от той, которая наблюдалась у животных-опухоленосителей контрольной группы. Исследование показателей эндогенной интоксикации выявило, что в группе крыс с лимфосаркомой Плисса без воздействия (контрольная группа) имело место статистически значимое снижение общей и эффективной концентрации альбумина и его связывающей относительно средних значений у интактных животных (крысы без опухоли). Это привело к кратному увеличению интегральных показателей эндогенной интоксикации – индекса токсичности и коэффициента интоксикации (см. рисунок 10).


* - отличается от значений в интактнойгруппе, p<0.05 – 0.01
** - отличается от значений в контрольной группе, p<0.05 – 0.01

Рисунок 10. - Изменение интегральных показателей эндогенной интоксикации в крови животных с лимфосаркомой Плисса при воздействии наночастиц магнетита (НЧ магн.) и магнитных железо-содержащих наночастиц допированных атомами самария (НЧ магн. доп.); в процентах по отношению к значениям в группе доноров, принятых за 100%.


    Перитуморальное введение НЧ магнетита крысам-опухоленосителям в суммарной дозе 106,2 мг/кг не усугубило проявлений эндогенной интоксикации. Напротив, отмечалось тенденция к повышению сорбционных свойств альбумина – увеличение ЭКА и ССА на 33 и 30 % соответственно, и снижение уровня МСМ (на 21-43%) относительно средних значений в контрольной группе, что привело к снижению интегральных показателей эндогенной интоксикации – индекса токсичности и коэффициента интоксикации, у большинства опытных животных. Перитуморальное введение допированных самарием магнитных железо-содержащих наночастиц в суммарной дозе 106,2 мг/кг сопровождалось увеличением общей концентрации альбумина до уровня нормативных значений, повышением ЭКА и снижением МСМ относительно значений в контрольной группе на 28 % и 20 % соответственно. Наблюдалось статистически значимое кратное снижение коэффициента интоксикации и индекса токсичности относительно контроля. Таким образом, перитуморальное введение НЧ магнетита и допированных самарием НЧ в "больших" дозах не приводит к усилению эндотоксикоза, характерного для злокачественного роста и сопровождается тенденцией к нормализации исследованных показателей у большей части опытных животных.
    Изучение эффектов допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц на развитие перевивных опухолей различных гистотипов в зависимости от состава и структуры наночастиц, а также от дозы и способа введения в организм животных
    Эффекты НЧ магнетита без допирования и НЧ магнетита, допированных самарием, вводившихся внутрибрюшинно, пери- и интратуморально были изучены в экспериментах на 250 крысах с перевивными саркомой 45 и лимфосаркомой Плисса и 74 мышах линии С57 Black c меланомой В 16, самцах и самках. Исследованные НЧ вводили в двух разных дозах, "большой" (разовая - 17.7 мг/кг) и "малой" (разовая - 1.25 мг/кг). Трансплантацию опухолей осуществляли путем инокуляции взвеси опухолевых клеток в заднебоковую поверхность спины по стандартной методике. Ежедневно осуществляли наблюдение за общим состоянием животных и взвешивание, определяли размеры опухолей. В случае лимфосаркомы Плисса наблюдалась регрессия опухоли разной степени выраженности, вплоть до полной регрессии. У крыс с саркомой 45 эффект выражался в торможении роста опухоли (до 4 раз), а также в её полной или частичной (на 40-60%) регрессии. У мышей линии С57 Black наблюдалось торможение роста меланомы В 16 и/или увеличение продолжительности жизни животных (см. рисунок 11). При использовании допированных самарием и не допированных НЧ магнетита в «малой» дозе наблюдалось усиление их противоопухолевого действия, что выражалось в существенном увеличении числа случаев полной и выраженной (не менее чем в 2 раза) регрессии опухоли (см. рисунок 12).

 

* - отличается от значений в контрольной группе, p<0.05 – 0.01

Рисунок 11. - Увеличение продолжительности жизни мышей-самок линии С57Black/6 с растущей меланомой В16 при воздействии наночастиц магнетита (НЧ магн.) и слабого инфранизкочастотного магнитного поля (МП). Обозначения: 1 п/г - подгруппа животных с наиболее выраженным эффектом, 2 п/г - подгруппа животных с менее выраженным эффектом.



Рисунок 12. – Усиление противоопухолевого эффекта НЧ магнетита без допирования (НЧ магн.) у крыс с лимфосаркомой Плисса при дополнительном центральном магнитном воздействии и снижении дозы. 


    Сравнение эффектов на опухоли животных допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц с влиянием наночастиц магнетита и переходных биогенных металлов.
  Сравнительное изучение противоопухолевой эффективности введения НЧ оксида меди (средний диаметр частиц 70-80 нм, сферической формы) и допированных атомами самария магнитных железо-содержащих НЧ было проведено на беспородных крысах-самцах с лимфосаркомой Плисса. В целом, доля животных с эффектом от введения наночастиц для крыс, получавших допированные НЧ магнетита составила 78%, а для крыс, получавших НЧ оксида меди – 71%. В отличие от допированных самарием железо-содержащих наночастиц, проявивших большую эффективность при внутрибрюшинном способе введения ингибирование роста лимфосаркомы Плисса наночастицами меди было наиболее выраженным при внутриопухолевом способе введения, при котором отмечалась регрессия опухоли различной степени выраженности в 55 % случаев (у 11 из 20 крыс), торможение роста опухоли у 25% крыс, рост опухоли у 20% животных. В то время как внутрибрюшинное введение наночастиц меди вызывало регрессию лимфосаркомы в 43% случаев (у 6 из 14 крыс), торможение роста у 14 % и рост опухоли у 43 %  животных.
Модификация противоопухолевого влияния наночастиц магнетита, переходных биогенных металлов и допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц с помощью низкоинтенсивных магнитных воздействий (активационная магнитотерапия). Сравнение полученных эффектов с использованием циклического аденозин-монофосфата (ЦАМФ) при злокачественном процессе.
Магнитное воздействие осуществляли на голову крыс. В случае экспериментов на мышах линии С57 Black применяли общее воздействие с одновременным облучением 5 животных, находившихся в специальной камере. Электромагнитное воздействие осуществляли с помощью аппарата «Градиент-2» по алгоритмам активационной терапии, для чего использовали ИНЧ МП нескольких частот в диапазоне 0.03 – 9 Гц, индукцией не более 3.5 мТл. Введение НЧ осуществляли перитуморально 2-3 раза в неделю (в разных экспериментах). Курс воздействий составлял 2.5-3.5 недели. Интерес представляло сопоставление эффектов комплексного воздействия с эффектами модифицированной циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ) химиотерапии опухолей в с вязи с важной регуляторной ролью цАМФ как универсального вторичного мессенджера и перспективностью дальнейшего использования этого фактора для модификации эффектов магнитных НЧ. Было изучено комплексное влияние магнитного воздействия и наночастиц-ферримагнетиков (допированных самарием и без допирования) при их перитуморальном введении у крыс с лимфосаркомой Плисса. А также сравнения эффектов этих факторов с действием модифицированной цАМФ химиотерапией  животных с крупными опухолями. Терапия включала ежедневное в течение 15 дней введение per os через желудочный зонд цАМФ (0,03 мг/мл) и 4-х кратное с интервалом 5 дней внутрибрюшинное введение циклофосфана.
    Аналогично тому, что было отмечено при использовании НЧ магнетита, допированных и без допирования, в случае комплексного действия слабого поличастотного магнитного излучения и наночастиц-ферримагнетиков наблюдалась связь противоопухолевого и антистрессорного влияния исследованного комплексного воздействия. Добавление магнитного воздействия усиливало антистрессорный и противоопухолевый эффект наночастиц-ферримагнетиков (см. рисунок 13) с допированием и без допирования (в 1.2-2 раза).


Рисунок 13. - Сравнительная динамика роста лимфосаркомы Плисса при внутрибрюшинном введении наночастиц магнетита оксида меди и магнитных железо-содержащих наночастиц допированных атомами самария. 


    Проведена отработка методики изучения распределения наночастиц оксидов железа в опухоли, тканях перитуморальной зоны. На рисунке 14 показана двумерная карта распределения железа в тканях перитуморальной зоны, полученная рентгенофлюоресцентным методом на двухмерном микро-РФ спектрометре M4 TORNADO (Bruker).


Рисунок 14. – Двумерная карта распределения железа в ткани перитуморальной зоны.